蛋白表达水平检测方法有哪几种?
免疫印迹法（WB，Western blotting）：是常用的蛋白质检测方法，通过特异性抗体与目标蛋白质结合来检测目标蛋白质的表达水平。免疫组化法（IHC）：是一种在组织学样本中检测蛋白质表达的方法，利用特异性抗体结合目标蛋白质，再通过染色或荧光信号来检测目标蛋白质的表达水平。
双缩脲试剂检测 准备双缩脲试剂和待测样品。将双缩脲试剂A液和B液混合均匀。加入待测样品至双缩脲试剂中，充分混合。观察颜色变化，如果产生紫色反应，则说明样品中含有蛋白质。紫外吸收法 准备待测样品和试剂，如蛋白质标准品、蛋白质稀释液等。
蛋白质微阵列：Protein microarray蛋白质微阵列是一种高通量的蛋白质印迹技术，可以同时检测大量蛋白质的存在和相互作用。它将多个蛋白质固定在芯片上，并与样品中的蛋白质相互作用，通过荧光或放射性标记的方法来检测和定量蛋白质的存在。
测定白蛋白的方法主要有以下几种： 溴甲酚绿法。这是一种较为常用的测定白蛋白的方法。其原理是白蛋白可以与溴甲酚绿结合，产生蓝色化合物，然后通过比色法或光电比色法进行检测。这种方法操作简便，且对白蛋白的测定具有较高的准确性。 免疫化学方法。包括免疫比浊法和免疫电泳法。
免疫印迹法是一种常用于检测蛋白质的方法，通过将蛋白质样品进行电泳分离，然后转移到固体载体上，再通过与特异性抗体反应，使用化学或光学方法检测特定蛋白质的存在和表达水平。这种方法对于检测单一或少量蛋白质非常有效，但是需要耗费较长时间进行实验操作和数据分析。
靶基因验证的方法一般有几种?双荧光素酶活性实验与westblot实验比较的...
第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。请问具体的实验设计：选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。
为什么荧光素酶互补实验结果阴性也有
由于双荧光素酶载体表达出来的circRNA序列不能成环，所以做circRNA与miRNA靶向关系检测时并不能完全模拟细胞内环境，还需要其他实验来进行佐证。
两者的结果检测方法不同。gfp绿色荧光蛋白，很直观，能够直接检到荧光，在普通的细胞培养条件下都能够观察到，对细胞的生命活动和其他并行的实验安排影响很小。荧光素酶报告基因使用起来比gfp多一个步骤，因为荧光素酶是个酶，不发荧光，发荧光的是它的底物，荧光素。
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。
什么是荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因?
1、荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，具有检测灵敏度高，没有信号背景，并且不损害植物的优点。
2、绿色荧光蛋白最初来源于太平洋海域的发光水母Aequorea victoria，这是一种在受到外界刺激时会发出绿色荧光的生物。在此之前，科学家们已知一些陆地生物如萤火虫和海洋生物如发光水母、珊瑚和鱼类拥有发光能力，但绿色荧光蛋白的发现开启了一种全新的生物标记技术。
3、绿色萤光蛋白（green fluorescent protein），简称GFP，这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca+2）可产生交互作用。
4、分泌型碱性磷酸酶（SEAP）是胎盘碱性磷酸酶的突变体，无需裂解细胞即可检测，PNPP和黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸作为底物，可分别提供低和高灵敏度的测定方法。荧光蛋白家族，如绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP），无需辅助因子即可发出荧光，为研究细胞内事件提供了无损手段。
5、目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）、分泌型碱性磷酸酶基因（seap）、绿色荧光蛋白基因（gfp）等。如：绿色荧光蛋白（gfp）基因。
如何预测和鉴定miRNA的靶基因
用一些预测软件，例如TargetScan、miRDB等。可以同时使用几个软件预测，挑选出重叠的靶标，进行靶标验证。一般预测的靶标都是3UTR区有结合位点，因此通常使用双荧光素酶报告实验来证明是否真的是直接靶标。然后通过mimics、inhibitor处理，发现靶标确实发生了相应的变化则证明为直接靶标。
**基因名搜索**：输入mRNA的基因symbol、EntrezID、EnsemblID或RefseqID，选择5UTR、CDS或3UTR区域（通常首选3UTR），点击下载。 **miRNA搜索**：输入miRBase ID，或者miRNA的短名称或家族名称，搜索后选择3UTR，miRWalk数据库的预测结果和12个外部数据库的结果可供下载。
预测终归是预测，miRNA的靶基因还必须经过验证。这个过程与一开始寻找靶基因的过程相似，也就是抑制或过表达miRNA，然后检查mRNA或蛋白水平的反应。生物通 目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法。
实验验证相对复杂，主要通过荧光定量PCR和Western blot来检测miRNA影响下的基因表达变化，确认靶基因关系。转染或敲低miRNA的方法包括构建过表达载体（如pri-miRNA序列）和瞬时表达人工合成miRNA。荧光素酶报告基因法则是鉴定miRNA靶位点的常用技术，通过改变miRNA表达并检测荧光素酶活性来确认靶位点。
然后由Exportin 5等转运至细胞质。Dicer将pre-miRNA切割成约22nt的双链miRNA，双链miRNA讲解形成单链的成熟miRNA。成熟miRNA还需要与Argonaute蛋白等组装形成RNA诱导沉默复合体（RISC），RISC作用于特异mRNA的3’UTR，从而抑制翻译过程或者直接讲解mRNA。
操作演示如下：预测mRNA与miRNA关系：输入mRNA ID（如GAS10608或ENSG00000148935），点击搜索，支持5UTR、CDS和3UTR数据，推荐下载3UTR区域。预测miRNA-mRNA关系：输入miRNA ID（如hsa-miR-214-3p）或miRNA家族名称，同样支持多个数据库预测，点击搜索后下载3UTR数据。